主题：人类基因组计划专题

第一节 人类基因组计划的概述

一、人类基因组计划的由来 　　在人类刚刚进入２１ 世纪的时候，回顾过去一百年中所取得的辉煌成就，最激动人心的伟大创举之一就是和“曼哈顿原子弹计划”、“人类登月计划”一起被誉为本世纪科学史上三个里程碑的“人类基因组计划 (Human Genome Project, HGP)”。这一人类历史上最伟大的工程从讨论到实施经历了十几年的时间。 　　1984年, 在美国Alta Utah 召开的专业会议上，一些科学家已开始讨论对人类基因组ＤＮＡ 进行全序列分析的前景。 　　1985 年5 月，在美国加州的 Santa Cruz 由 Robert Sinsheimer 组织的专门会议上，提出了测定人基因组全顺序的动议. 　　1986年，美国生物学家、诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco 在“Science”上发表短文首次提出人类基因组计划的设想，并建议组织国家级和国际级的项目来进行这方面的研究。 　　1986年3月， 美国能源部在召开的一次专门会议上， 正式提出实施测定人类基因组全顺序的计划。 　　1988年4月，国际人类基因组织（HUGO）成立。 　　1988年10月美国能源部和美国国立卫生研究院达成协议，共同管理和实施这一计划。 　　1990年10月由美国国会批准正式启动ＨＧＰ 研究，随后法国、英国、意大利、德国、日本等也相继宣布开始各自的ＨＧＰ 研究。中国于1987年在“863计划”中开始设立人类基因组研究课题。 　　二、人类基因组计划的目标 　　人类基因组计划是一项国际性的研究计划。它的目标是通过以美国为主的全球性的国际合作，在大约15年的时间里完成人类24条染色体的基因组作图和DNA全长序列分析，进行基因的鉴定和功能分析。人类基因组计划的“科学产品”将是一个人类遗传信息数据库，将是一本指导人类进化的“说明书”。 人类基因组计划的最终目标就是确定人类基因组所携带的全部遗传信息，并确定、阐明和记录组成的人类基因组的全部DNA序列。 　　有人将HGP比作一张20世纪的生命（生物学）周期表，因为它一改经典分子生物学零敲碎打地研究个别基因的习惯，而力求在细胞水平上解决基因组的问题，同时研究10万个基因及其产物，以建立对生命现象的整体认识。 　　三、人类基因组研究的应用 　　人类基因组计划的成果不仅可以揭示人类生命活动的奥秘，而且人类6千多种单基因遗传性疾病和严重危害人类健康的多基因易感性疾病的致病机理有望得到彻底阐明，为这些疾病的诊断、治疗和预防奠定基础。同时，人类基因组计划的实施还将带动医药业、农业、工业等相关行业的发展，产生极其巨大的经济效益和无法估量的社会效益。要想完成这样一个雄心勃勃的计划，必须要发展一系列新的实验技术及手段为科学家、医生及其他研究者所共享，从而使研究成果能够尽快的服务于公众。 　　日新月异的生物医学研究是人类基因组计划的另一受益者。随着计划的不断发展，将培养出能熟练使用研究工具、利用知识资源、从事使整个人类的健康水平不断提高的生物学家。自从人类基因组计划一开始，人们就清楚地认识到获得和利用这些遗传学知识对个人、社会都具有重大意义。社会也形成了许多关于公众和专业讨论的政策机构，参与人类遗传学研究与伦理、法律及社会有关问题的分析。 　1、 在医学领域的应用 　　（1）对特殊疾病基因的确定 　　人体的各种器官系统和组织常受到各种特殊疾病的侵袭，这些疾病对人类健康关系重大，但通过常规医疗手段无法进行诊断和治疗。通过认识这些疾病的基因序列及确定发生了规律性改变的DNA片段，为这类疾病的诊断和治疗提供了可能。比如，杜兴肌营养不良、慢性肉芽肿、视网膜母细胞瘤、亨廷顿氏舞蹈症和家族性早老年痴呆症等基因就是依赖于人类基因组计划的实施。 　　各种人类基因组图谱会使寻找与特定遗传疾病有关的基因的工作变得容易。以限制性内切酶酶切片段长度多态性（RFLPs）为基础的精细遗传连锁图谱将很快地使与疾病有关的位点定位在染色体亚区上成为可能。 　　利用DNA克隆库和限制酶切图谱，人们可以对正常的患者的DNA进行有效的分析比较，达到对某一疾病的基因进行定位的目的。 　　人类基因组的DNA全序列将有助于证实假定存在的所有基因，可为分析病人DNA样品的序列提供一个数据库。 　　（2）有利于优生和产前诊断 　　人类对基因组的了解会推动对遗传性疾病的诊断和预防。随着分离到的疾病基因的增多，以DNA为基础的诊断会更为普遍。医生和遗传学家可以通过基因检测，识别出带有遗传疾病的胚胎细胞，比如：囊性纤维变性和镰状细胞性贫血。 　　在不久的将来，胎儿期的检测也许能够预测一般的常见病，比如：肥胖症、抑郁症和心脏病等。 　　应用遗传座位专一性的分子探针，可检测出疾病基因的携带者，将使父母了解其子女出现遗传缺陷的危险程度。 　　（3）加强对癌症的认识和治疗 　　癌症的高死亡率严重地威胁着人类生命。癌症是由于细胞生长失控造成的。分子遗传学研究表明，细胞分裂的失控是因为特定基因的异常造成的。遗传的缺陷通常会使人体对特定的癌症具有高的易感性。寻找与癌症相关的基因的研究是当前医学研究的热点之一。人类基因组计划将会大大地促进这方面的研究。一旦确定了易感基因，就可以进行癌前或早期癌症的特殊监护和治疗。 　　尽管，人类对癌症的认识已有很大的进步，但是仍然存在着许多问题。何种正常蛋白质参与了细胞生长？这类蛋白质的改变如何使细胞发展成肿瘤，进而扩散到远处的器官？这些变化的远遗传机制是什么？人体肿瘤的癌基因或癌转移有关基因的类型如何？这些问题的解决将依赖于人类基因组计划的研究。 　　（4）有利于医学生物学的研究 　　1）确定人类基因组中的转座子（transposon）、逆座子(retroposon)和病毒残余序列的分布,了解有关病毒基因组侵染人类基因组的情况, 可指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。 　　2）对染色体和个体之间的多样性的研究结果可被广泛用于基因诊断、个别识别、亲子鉴定、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学的研究中。 　　3）研究DNA的突变、重排和染色体断裂等, 了解疾病的分子机制, 包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病和感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程, 为这些疾病的预后以及分子水平上的诊断、预防和治疗提供依据。 　　2、在基础理论研究方面的应用 　　（1）确定人类基因组中基因的序列、组织和物理位置，有利于研究基因的功能以及它们相互之间在表达和调控机制方面的联系。 　　（2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，有助于从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后的调控。 　 （3）从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小。了解各种重复序列和非转录序列在染色体结构、DNA复制、基因转录和表达调控中的影响和作用。 　　（4）研究空间结构对基因调控的作用。有些基因表达的调控序列与被调控基因从直线距离上看，似乎相距较远，但若从整个染色体的空间结构上看则恰恰处于最佳的调控位置。因此有必要从三维空间的角度来研究真核基因的调控。 　　（5）研究正常基因与突变基因的差别，会帮助阐明与正常的生理学和疾病发生都有关的新的生化和细胞学机制。尽快地确定出疾病基因，能使研究者对该基因的蛋白产物及其细胞生物学效应进行深入的研究。 　　（6）有利于确立有重要功能意义的基因组组构的特征。 人类染色体含有许多不是基因的片段， 一些特定片段对细胞分裂前染色体复制和确保染色体组正确地分配到两个子细胞中是不可缺少的。 这些片段的性质及行使功能的机制鲜为人知，人类基因组的物理图谱将为探讨这些特定片段性质及作用的实验打下基础。 　　（７）发现新的基因和蛋白质。迄今仅有少数参与正常和疾病的人类基因被确定。对人类基因组作图和测序将会确定出大量新的人类基因及其编码的蛋白质。另外，物理图谱将有助于对那些已大体定位在染色体上，但尚未分离出的基因进行精确定位。 　　3、在生物学研究领域的应用 　　（1）生物进化研究 　　人类基因组记载着人类的进化史。如果知道了人和其它生物基因组的全序列，就有可能追溯出人类基因的起源。因为所有哺乳动物有着相似的蛋白质谱，所以哺乳动物之间的差异主要表现在受控的基因表达的时间、表达的水平，以及细胞类型专一的调控信号等方面。人胚胎的有序发育需要特定的场所和时间的活化，使多潜能细胞成为新类型的细胞，这一过程至少部分地受控于位于基因附近的调节顺序。这些顺序在其活化的基因中大多是同源的。对人类基因组进行顺序分析，并将与其它哺乳动物进行比较，将使我们能确定出大量的调节顺序。此外，我们将了解基因调控的规律，及其在人从其它哺乳动物分化出来的过程中在分子水平上所发生的变化。 　　人类基因组研究的目的，不是为了单纯地积累数据，而是要揭示大量数据中所蕴藏的内在规律，从而更好地认识和保护生命。对基因和蛋白质结构数据的大量分析表明，生命体基因组所含的基因数量与基因编码的蛋白质的基本结构单位数存在着较大的差距，前者为105，后者仅为103左右。说明数量有限的蛋白质编码区段的倍增、重排和融合，产生了大量含有多个模块的复合基因，构成了庞大而复杂的人类基因组所编码序列。如果把一个基因比作一个个体，那些起源于同一祖先，在不同生物体中行使同一功能的基因群就可比作为一个门类，这些类似的基因被称为“直向同源物（Ortholog）”。 另一方面，同一生物体中由同一基因复制而产生的多个蛋白质的基因称为“横向同源物（Paralog）”。α-珠蛋白、β-珠蛋白和肌红蛋白的基因就是典型的Paralog的例子，它们是由脊椎动物中的祖先珠蛋白基因复制而来的。近年来， 由于基因资料的骤增，人们发现所有生物体中都富含Paralog的关系。 　　（2）分子考古研究 　　真核生物基因组中，编码序列仅占一小部分，而绝大部分的序列是非编码序列。其中相当于转座元件的重复序列家族又占据了相当大的一部分。转座元件可以通过RNA中间产物的逆转录，或DNA自身的切割和整合来完成转座功能。已知的转座因子可分为四类：短散在元件（SINE）、长散在元件（LINE）、长末端重复顺序逆转录病毒样元件和DNA转座子。 　　研究表明，在人类基因组中存在着11x105个Alu顺序（一种SINE）和59x104个Linel顺序（一种LINE）。另外，基因组中某些不确定的系列可能也是由散在的重复系列组成，只是这些重复系列已相当退化而难以识别。有人推测，若能识别出退化的重复系列，则有可能50％的人基因组和50％以上的鼠基因组是由重复序列组成的。重复序列可能具有以下功能：（1）作为特异组织表达基因调控区内的重复序列；（2）通过易化同源重组、转座或倒位重塑基因组结构；（3）可能与基因组外现象（亲代印迹、位置作用的多样性等）有关。由于重复序列出现和持续的年代可由种系之间的比较来确定，它们可作为一种很有价值的时间标志，用于分子考古学的有关复杂基因位点的研究。

第二节 人类基因组研究的主要内容

一、建立遗传图谱 　　1、遗传图谱 　　遗传图谱（genetic map），又称连锁图（linkage map），是指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离。遗传距离通常由基因或DNA片断在染色体交换过程中分离的频率厘摩（cM ）来表示。1厘摩表示每次减数分裂的重组频率为１％。厘摩值越高表明两点之间距离越远，厘摩值越低表示两点间距离越近。 　　2、遗传图谱的应用 　　通过遗传图谱，我们可以大致了解各个基因或DNA片断之间的相对距离与方向，如哪个基因更靠近着丝粒，那个更靠近端粒等。遗传距离是通过遗传连锁分析获得的，实用的DN厘摩A标志越多，越密集，所得到的遗传连锁图的分辨率就越高。遗传图谱不仅是现阶段定位基因的重要手段，即使在人类基因组全物理图谱建立起来之后，它依然是研究人类基因组遗传与变异的重要手段。3、遗传图谱的绘制及进展 　　遗传图谱的绘制需要应用多态性标志。最早应用的标志是限制性酶切片段长厘摩多态性（RFLP）进行遗传图谱的绘制. 80年代后期,人们开始应用短串联重复序列（short tandem repeat, STR）, 又称微卫星(microsatellite, MS)标志绘制图谱。1994年底，美、法完成了以RFLP及微卫星ＤＮＡ为标志的遗传图谱. 图谱包含了5826位点，覆盖4000cM ，分辨率高达0.7cM．1996年法国报道了完全以微卫星DNA标志构建的遗传连锁图，包含2335位点，分辩率为1.6cM。 　　MS的出现不但使遗传图的精度得到了进一步提高，同时也成为物理图谱上的标志，从而促进了遗传图谱与物理图谱的整合。近年来，第三代的多态性标志，即单个核苷酸的多态性（singlenucleotide polymorphism, SNP）标志又被大量使用，其意义已超出了遗传作图的范围，而成为研究基因组多样性和识别、定位疾病相关基因的一种新手段。 　　最近发表的遗传图谱有GENETHON图和CEPH图，前者包括了5264个微卫星标志，后者含有7950个微卫星标志。这些大量地分布与人类整个基因组的遗传图谱使得个别实验室的研究者可以把他们自己的研究成果整合入全球范围的数据库中。 　　两个物理位置相距很近的基因或DNA片段可能具有较大的遗传距离 　　二、建立物理图谱 　　1、物理图谱 　　物理图谱（physical map）是指DNA序列上两点的实际距离，通常由DNA的限制酶片段或克隆的DNA片段有序排列而成。物理图谱反应的是DNA序列上两点之间的实际距离，而遗传图谱则反应这两点之间的连锁关系。在DNA交换频繁的区域，两个物理位置相距很近的基因或DNA片段可能具有较大的遗传距离， 而两个物理位置相距很远的基因或DNA片段则可能因该部位在遗传过程中很少发生交换而具有很近的遗传距离。 　　2、物理图谱的应用 　　物理图谱是进行DNA分析和基因组织结构研究的基础。限制酶物理图还是基因组结构的重要特征，例如，每个基因都有特定的限制酶谱，每一条染色体，每一个个体的基因组都具有其特异的限制酶物理图。 　　3、物理图谱绘制的进展 　　根据物理图谱的原定目标，首先要获得分布于整个基因组的3万个序列标签位点（sequence tagged site, STS）。标签位点是指染色体定位明确，并且可用PCR扩增的单拷贝序列，每隔100kb距离就有一个标志。然后，在此基础上构建能够覆盖每条染色体的大片段DNA连续克隆系。 　　到1995年为止，已经完成了几张基因组水平的人类STS图，即由Genethon制作的包含5264个遗传标志的图谱、由Genethon和剑桥大学制作的含有850个STS的RH(radiationhybrid)图和麻省理工学院与Genethon制作的有15086个STS的整合YAC-RH图。另外，由法国人类多态性研究中心(CHPH)制作的225个YAC连续克隆群已可覆盖整个人类基因组的75％，该图上有2061个STS。这些图谱为进一步定位其它基因座位提供了详细的框架。 　　三、DNA序列测定 　　人类基因组计划最终将测定出人类基因组的全部序列。这种序列测定不同于以往那种只对某一个特定的感兴趣的区域进行DNA序列分析的工作。它要求一种更高效的规模测序，并将测出的每一个DNA片段按其染色体位置进行准确的排列， 从而得到人类基因组DNA序列碱基排列的全貌。这是一个很艰巨的任务，目前的DNA序列分析技术还不能完全满足这一任务的需要，有必要开发更新的序列分析技术和计算机信息处理系统。这些新技术和新系统的开发与研制也将成为人类基因组计划的一个重要组成部分。 　　四、基因的确定和分析 　　确定每一个基因，研究它的结构、特性和功能是人类基因组计划的又一个重要内容。 通过对人类基因组全部DNA序列的测定， 可以利用计算机找出分布在DNA两条互补链上所有可能编码蛋白质的基因。其中有一部分是人类已了解的基因，但更多的是我们尚不完全了解的“基因框架”，我们称这些结构为可译框（ORF）。在DNA结构特征上ORF含有翻译的起始密码子、外显子及内含子的剪接信号、翻译终止信号和3''poly(A)加尾信号。根据中心法则，人们可以预测某种ORF编码的蛋白质的氨基酸序列，甚至这个蛋白质的空间结构及功能。应该指出的是，人类要真正破译所有的ORF的功能及其生物学意义还需要相当长的时间。目前的人类基因组研究只是为实现这一最终目标提供最基本的素材----DNA 序列以及基因的结构特征。 　　科学界早已在思索人类基因组序列和结构清楚后的下一步工作。 有人提出了“后基因组计划”（post-genome project）的构想。“后基因组计划”的研究内容就是对基因组的功能进行探索。还有人提出了“蛋白质组”（proteome）计划、“环境基因组学”（environmental genomics）、“癌肿基因组解剖学计划”（Cancer Genome Anatomy Project, CGAP）。总之，人类基因组计划的内涵和外延将不断地扩展。

第三节 人类基因组研究的策略

一、人类基因组研究的基本思路 　1、“Tackle all the chromosome at once” 　　（1）建立插入人类基因组片段的酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）克隆群。 　　（2）利用高频分布，易于检索的DNA标志或者DNA指纹图谱建立克隆之间的联系，组成有序排列的连续克隆系，最常使用的DNA标志有专一序列位点（sequence ragged site，STS）和表达的序列标签（expressed sequence tag，EST）。 　　（3）将克隆群定位于染色体的不同区域，构成完全基因组物理图谱。 　　（4）进行次级克隆，序列分析。 　　2、大片段外源DNA克隆体系 　　（1）酵母人工染色体克隆体系（YAC） 　　这种克隆体系是八十年代末发展起来的，并于1990年底渐趋完善的大片段外源DNA克隆体系。插入YAC载体的外源DNA片段可达200－1 000kb甚至更多，并能稳定复制。现在YAC已成为构建复杂基因组的有力手段。 　　（2）粘粒克隆，P1噬菌体和细菌人工染色体 　　粘粒克隆的出现早于YAC，其主要特点是插入的外源片段比λ噬菌体克隆大一倍。因此在筛选基因文库是可以减少一半工作量。P1噬菌体的溶源状态奇特，不整合到宿主的染色体上，像质粒一样作为一个自主复制单位游离于宿主染色体以外。可以用于克隆75�110kb的外源DNA片段。电穿孔技术的发展为提高大质粒的转化效率创造了条件，已经可以构建和转化几十到几百kb的细菌人工染色体克隆（BAC）。 　　3．构建重叠度最低的连续克隆系 　　构建能覆盖每条人类染色体而重叠度又最小的连续克隆系，是进行 大规模基因组ＤＮＡ 测序的基本条件。由于这一做法很花时间，当测序中心将大规模测序计划上升至每年75Mb 或更多时，连续克隆系的构建速度可能跟不上测序产出的速度。1996年，有人提议对高覆盖率的 BAC文库的克隆进行末端测序，形成顺序标签接头（sequence tagged connector, STC），利用STC与克隆间的对应关系，可以在计算机上快速地发现局部连续克隆系。目前，这一工作方案已开始实施。 　　二、确定特定的基因 １、通过DNA全序列分析确定基因 　　人类基因组分析的一个重要内容是确定所有的单基因，通过研究单基因的结构、特性和功能，达到了解这些基因同人类健康、疾病和发育的内在关系。 　　当人们完成了全部DNA测序工作后， 可以利用计算机分析，找出分布在DNA两条互补链上的所有可能的可译框 (ORF)。例如， 对酵母第3号染色体DNA全序列分析发现了182个ORF，其中31个是已知存在于该染色体的基因， 29个与数据库中已知基因同源，然而发现了120多个ORF是“孤儿基因”。“孤儿基因”是指根据已有知识，还未了解其功能和生物学意义的基因。只有通过对基因组全序列的测定，才能真正准确地定位每一个基因。 　　那么，如何来判定“孤儿基因”的功能呢？可以通过以下几个途径： 　　（1）将“孤儿基因”的DNA序列与body map 中的数据进行比较，了解其是否表达以及表达的时空特异性，并根据这些提示去研究它的功能。 　　（2）根据该基因编码蛋白质的氨基酸序列，分析其功能结构域及可能的空间结构， 再结合染色体定位，研究与同样定位在该染色体区带上的遗传性状或疾病的联系，确定其功能。 　　（3）在实验动物中寻找它的同源基因，进行基因“敲除”，观察实验动物的生物学改变，以了解该基因的功能。 　　２、功能克隆 　　功能克隆是人类第一个基因克隆的策略。事实上不可能等到人类基因组DNA全部序列都测出之后，再去逐一了解每个基因的结构和功能，在实际研究中人们认识了一个基因，知道了它的功能之后，才去分离并测定其结构的。进行这一工作的步骤是： 　　（1）根据已知的生化缺陷特征确认与该功能有关的蛋白； 　　（2）分离纯化这一蛋白并测定出部分氨基酸顺序； 　　（3）根据遗传密码推测其可能的mRNA 序列； 　　（4）设计相应的核苷酸探针，杂交筛选cDNA或基因组DNA 文库，最终获得整个编码区乃至全基因序列。 　　３、定位克隆 　　由于许多基因遗传病的基因位点已经有了精确的染色体定位和相应的DNA标记，所以可以用定位克隆的策略分离这些基因。杜兴肌营养不良、慢性肉芽肿、亨廷顿氏舞蹈症等几十个基因的克隆分离就依靠此种方法。 　　（1）通过染色体缺失或平衡易位以及连锁分析，确定该基因在染色体上的位置，并将这个位置精确到2 000kb左右的范围内。 　　（2）利用距离该基因最近的DNA标志，筛选YAC库，采用染色体步移技术获得覆盖这个基因位点的一组连续的YAC 克隆。 　　（3）在这个DNA区域内巡找基因，可采用筛选cDNA文库、外显子捕获（exon trapping）、物理捕获（physical trapping）等方法确定该区域内表达序列的手段和寻找保守序列，寻找基因。 　　４、鉴定基因 　　首先通过对某个基因编码蛋白质的氨基酸序列分析，确定它属于哪一类的蛋白， 可能具有哪些功能。如果是一个遗传病基因， 应分析患者群体中该基因是否存在DNA突变，以及这些突变是否存在规律性。DNA突变包括：无义突变、移码突变及剪接信号位点上的改变等。对于由点突变导致的氨基酸改变，应该验证这一突变是否也存在于其它病例中，以及同一家族或同一地区的正常人群中是否也存在相同的改变。 还可以进行突变体体外功能实验和基因敲除动物检验来鉴定这个基因。如果经过一系列的检验， 证实这个基因并非是你所要克隆的基因，那么一切工作又要从头开始。 所以，要达到鉴定一个基因的目的，常常需要许多科学家的协同攻关。比如，亨廷顿舞蹈病基因的克隆，就是在一个由国际上多个高水平研究小组组成的团体的共同努力下完成的。 　　目前许多人体新基因及其功能被发现和研究，如：与智力发育相关的IGF2R基因；12号染色体上的TBX5 基因，其变异可导致携带者患候特氏症，这是一种罕见的发育缺陷症，可导致心脏和上肢畸形．美国科学家通过对８个有青光眼病史家族中百名患者的基因分析，确定引发青光眼的直接原因是TIGR基因发生了变异．迄今分离出的人体新基因还有结节状硬化症基因TSC1、新生儿癫痫病基因KCNQ2、胆固醇病基因NPC1、秃发基因、耳聋基因及与溃疡病有关的基因、反应迟缓基因等．与白血病、艾滋病及克雅氏症有关的基因也在进一步研究中．人体新基因的研究将了解各种遗传病、癌症、心血管病及神经和精神病的发病机制，提供诊断和防治途径，有助于从人类基因组中去除有害基因，从根本上治疗这些疾病。 　　三、利用染色体特征研究人类基因组 　　染色体的结构和功能特征，如核型、特殊带型、着丝点、复制起点、端粒序列、CpG岛、重复序列等对基因组作图、基因定位和克隆基因都是非常有用的。人们常常是结合染色体的结构和功能特征，采用不同的手段进行人类基因组研究。 　　１、杂交细胞系与染色缺失谱 　　杂交细胞系（somatic cell hybrid mapping panel, SCH）是由分别含有一条人1～22号和X、Y染色体的人、鼠杂交细胞株系构成的杂交细胞谱。将cDNA或DNA片段与SCH谱DNA杂交，即可将基因进行染色体定位。由同一染色体不同缺失与重排的杂交细胞株构成的染色体缺失谱还可对基因进行染色体区域定位。 　　由于自然发生的染色体缺失与重排数量有限，近来又建立了RH谱（radiation hybrid map）,或称IFGT（irradiation fusion gene transfer hybrids）. 分析时，首先用大剂量r射线照射含单条人染色体的杂交细胞株，使染色体断裂成数百kb左右的片段， 然后与鼠的细胞融合，筛选出一系列含人某一条染色体不同片段的杂交细胞，最后经过筛选、排序就可以将该染色体精细划分，用RH谱进行基因的精细定位。 ２、染色体核型 　　经研究发现，人染色体核型的R带GC含量高，复制早，与之结合的组蛋白乙酰化程度高，R带上基因密度高，CpG岛数目多，短基因间重复系列多，在肿瘤的X射线照射时，基因交换的频率高。而G带的AT含量高，复制早，与之结合的组蛋白乙酰化程度低，G带上基因密度低， CpG岛少， 长的基因间重复系列多， 基因交换频率低。 　　３、染色体显微切割 　　在显微镜下切割特定的染色体区带, 经PCR扩增, 重组,制备染色体区带特异的探针。这些探针用于筛选、分离染色体区带特异的粘粒或酵母人工染色体克隆, 建立连续克隆系与高分辨物理图谱。还可以用这些探针筛选cDNA文库，分离与该染色体区有关的表达基因的系列。 ４、染色体荧光原位杂交 　　染色体荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）可以用于cDNA或DNA片段的定位，以及研究几个DNA片段或基因之间的相对位置与方向。由FISH发展而来的DNA荧光原位杂交是采用不同颜色荧光标记的探针与散成长环状的DNA杂交，形似日晕，称为halos。这种技术可以区分和定向相距5kb的两个DNA片段。

第四节 人类基因组研究引发的社会和伦理问题

虽然，人类基因组计划给人类带来的益处是无可争议的，但是人们在开始实施这一计划起，就在考虑人类为获取这些益处所要付出的代价。 　　美国的《Time》杂志和美国的有线新闻网（CNN）曾为人类基因组计划的研究作了一项民意测验。结果发现，许多人对人类基因组计划怀有很深的矛盾心理。 当向应答者调查是否愿意接受遗传病的预测时，回答说不愿意的人为49％，与表示愿意的人（50％）几乎相当。除非是以治愈疾病和增加食物为目的，多数人反对任何其它的人类遗传工程研究。有58％的人认为改变人类的基因违反了自然的意志。 　　 1997年10月21日美国的一份报告披露， 由美国国家研究会的17名科学家、伦理学家和法学家组成的委员会就人类基因组多样性研究计划进行讨论。委员会主席William Schull 强调说:“虽然人类基因组多样性研究极有价值， 但是， 我们也许会看到，伦理和法律的争论可能成为最终的绊脚石， 而导致计划的失败”。 　　传统的伦理观念将产生变革，克隆被越来越多的人所接受，因为它可以使人们保持健康而不是产生更多的人。在不久的将来，人们也许会允许销售器官及基因。基因组计划的进行将迫使人类对许多超出人类目前认识范围的棘手问题做出决断。人们能否允许继续利用改变基因组的办法来改造人类自身，控制生育进程？甚至参与引导自然进化？没有任何人拥有一套尽善尽美的基因， 随着HGP 研究的不断深入， 能否借助科学的力量和智慧人为创造出一个”完美的基因组”? 应该从伦理学及法律上建立什么样的支持体系及干预措施? 这些都必然涉及到社会科学中伦理学和法律问题。 　　一、伦理和社会学方面 　　 1、如何解释遗传信息的医学意义 　　 人类基因组作图和测序工作将提供大量有关人类疾病的遗传学基础的新知识。不谨慎地解释有关基因与疾病相关的信息，将对携带这些基因但不会生病的人带来灾难。若无清楚的说明，人们很容易错误地解释临床疾病和特定遗传标志间的统计学上的相关性，从而作出该标志可用来诊断某种疾病的结论。遗传性对疾病的易感性、倾向性或患病的危险等概念是可变的，且时常令人模棱两可。如果过于强调预防疾病的措施将迫使一些人受到不必要的社会学和心理学压力。例如，HLAB27 阳性者可能患有关节强硬性脊椎炎（ankylosing spondilitis）,但是可能性仅为0.1%。如果误解或过分强调这类相关性，就会增加很多人的焦虑，并影响他们对将来的计划。此外，即使正确解释与疾病有关的产前诊断结果，仍然是有问题的。若无有效的治疗手段，预先知道疾病将会发生迫使医生和病人作出困难抉择。 　　随着对人类基因组研究的深入，越来越多的人将面临象现在的亨廷氏舞蹈症高危者所面临的作出选择时的困扰，当对其无能为力时，仅仅了解自己将面临的恶运，可能是不利的。所以，随着计划的深入开展，有必要努力去缩小而不是加剧疾病的诊断与治疗能力之间的差距。 　 2、遗传学隐私权将是下一代人激烈争论的宪法问题 　　在《时代周刊》和美国有线新闻网（ＣＮＮ）的一项民意测验中，应答者还明确地表示出了他们对人类基因组计划进展的忧虑。他们最担心的问题是隐藏在人类基因组中的秘密被公开化，从而很可能对个人带来一系列的不利的后果。 　　科学家和医学家会接到对某些性状和病况进行诊断的请求，这可能要涉及到从父母作出生育与否的决定到招聘职工的人事政策等。科学家们在考虑这些请求时，面临的困难又与检查结果的隐私权有关，是否应为某人或某机构的利益去对一个人进行检查？ 明显的例子是工厂或保险公司对可能提出对雇用的人或投保人进行遗传检验申请。 　　随着人类基因组计划的深入，对这些作法开展讨论和建立健全的社会政策的活动将成为社会关心和讨论的焦点问题。主要的议题是保障个人的自主权、遗传信息的所有权以及对基因图谱为基础的医学预测方法的解释。在很大程度上，任何社会政策的变化，反映着开展人类基因组计划的科学界对这些问题提出的方式。实际上，这一伦理学问题与用人的组织进行生物医学分析所涉及的问题相似，即必须保障提供者的隐私权和人身自由，就计划的大部分内容而言，做到这一点是不难的。随着计划实施的发展，应重新确认遗传学家的传统愿望，即承担作出是否违反保密准则的决定的责任，并且只有在已鉴定出个体会出现严重的可以避免的疾病的机率极高时，才能违反保密原则。 　　3、合理地使用研究成果 　　如何利用人类基因组计划所产生的信息是最大的社会问题。作为计划的副产品，大量新的针对某些性状和病况的试验将会得到应用。也很有可能被用于人事和保险等有关政策等中。前面提到的美国《时代周刊》和美国有线新闻网（ＣＮＮ）的民意测验中，应答者还担心隐藏在人类基因组中的秘密有可能被用来对抗人类。一滴血或一绺头发中就包含了所有的遗传信息。雇主或承保人会根据这些信息去判断某人是否有许多种使其衰弱的疾病的危险。在被调查者中，９０％ 的人认为保险公司根据遗传检测决定是否为某人保险属违法行为。实际上，这种行为在美国是完全合法的。在被研究的家族中，也会出现不恰当地使用遗传信息的伦理学问题。例如，要不要限制父母决定子女应有何种遗传性状的权利？ 传统上，限制是以病情为基础的，对无病理意义的检查要求，象性别鉴定这样的请求，通常应遭到拒绝。然而，非病理和病理性的界限是不清楚的，随着可用的与性状相关的遗传学标志的增多，产前即能分析这些标志的能力，使临床遗传学家感到困难。 　　二、 商业与法律方面 　　人类基因组计划将会产生一些有潜在商业价值的新信息和材料。这些信息和材料就象编码那些尚未发现的激素、生长因子或免疫介质一样，它们的商业价值也存在保护参与者贡献的智力与知识产权和所有权的问题。是否有可能对人类基因组的序列实行版权法？由谁来执行？政策中某一中心机构是否享有计划所产生的ＤＮＡ克隆这样的新材料的专利？ 这些复杂问题应该由全世界的科学家、律师和政策决定者来共同研究。这些问题在前一段时间内，科学界进行了激烈的讨论，且基本上达成共识：人类基因组序列是全人类的共同财富，不应对它的使用进行限制。 　　对于人类基因组计划产生的伦理、社会、法律等难题，应该通过伦理观念的改变和法律的约束来解决，同时也应赋予遗传学家和医学工作者一定的责任和义务。

第五节 人类基因组计划的研究现状与展望

一、研究现状 　　１、人类基因组测序 　　1990年～1998年，人类基因组序列已完成和正在测序的共计约330Mb，占人基因组的11％左右；已识别出人类疾病相关的基因200个左右。此外，细菌、古细菌、支原体和酵母等17种生物的全基因组的测序已经完成。 　　值得一提的是，企业与研究部门的携手，将大大地促进测序工作的完成。美国的基因组研究所（The Institute of Genome Research, TIGR）与PE（Perkin-Elmar）公司合作建立新公司，三年内投资2亿美元，预计于2002年完成全序列的测定。这一进度将比美国政府资助的HGP的预定目标提前三年。美国加州的一家遗传学数据公司(Incyte)宣布（1998年〕，两年内测定基因组中的蛋白质编码序列以及密码子中的单核苷酸的多态性，最后将绘制一幅人的10万个基因的定位图。与Incyte公司合作的HGS（Human Genome Science）公司的负责人宣称，截止1998年8月，该公司已鉴定出10万多个基因（人体基因约为12万个），并且得到了95％以上基因的EST（expressed sequence tag）或其部分序列。 　　1998年9月14日美国国家人类基因组计划研究所（NHGRI）和美国能源部基因组研究计划的负责人在一次咨询会议上宣布，美国政府资助的人类基因组计划将于2001年完成大部分蛋白质编码区的测序，约占基因组的三分之一，测序的差错率不超过万分之一。同时还要完成一幅“工作草图”，至少覆盖基因组的90％，差错率为百分之一。2003年完成基因组测序，差错率为万分之一。这一时间表显示，计划将比开始的目标提前两年完成。 　　２、疾病基因的定位克隆 　　人类基因组计划的直接动因是要解决包括肿瘤在内的人类疾病的分子遗传学问题。6000多个单基因遗传病和多种大面积危害人类健康的多基因遗传病的致病基因及相关基因，代表了对人类基因中结构和功能完整性至关重要的组成部分。所以，疾病基因的克隆在HGP中占据着核心位置，也是计划实施以来成果最显著的部分。 　　在遗传和物理作图工作的带动下，疾病基因的定位、克隆和鉴定研究已形成了，从表位→蛋白质→基因的传统途径转向“反求遗传学”或“定位克隆法”的全新思路。随着人类基因图的构成，3000多个人类基因已被精确地定位于染色体的各个区域。今后，一旦某个疾病位点被定位，就可以从局部的基因图中遴选出相关基因进行分析。这种被称为“定位候选克隆”的策略，将大大提高发现疾病基因的效率。 　　３、多基因病的研究 　　目前，人类疾病的基因组学研究已进入到多基因疾病这一难点。由于多基因疾病不遵循孟德尔遗传规律，难以从一般的家系遗传连锁分析取得突破。这方面的研究需要在人群和遗传标记的选择、数学模型的建立、统计方法的 改进等方面进行艰苦的努力。近来也有学者提出，用比较基因表达谱的方法来识别疾病状态下基因的激活或受抑。实际上，“癌肿基因组解剖学计划（Cancer Genome Anatomy Project,CGAP”就代表了在这方面的尝试。 　　４、中国的人类基因组研究 　　国际ＨＧＰ 研究的飞速发展和日趋激烈的基因抢夺战已引起了中国政府和科学界的高度重视。在政府的资助和一批高水平的生命科学家带领下，我国已建成了一批实力较强的国家级生命科学重点实验室，组建了北京、上海人类基因组研究中心。有了研究人类基因组的条件和基础，并引进和建立了一批基因组研究中的新技术。中国的HGP在多民族基因保存、基因组多样性的比较研究方面取得了令人满意的成果，同时在白血病、食管癌、肝癌、鼻咽癌等易感基因研究方面亦取得了较大进展。 　　首先建立了寡核苷酸引物介导的人类高分辨染色体显微切割和显微基因克隆技术；已建立的17种染色体特异性DNA文库和24种染色体区特异性DNA文库及其探针；构建了人X染色体YAC图谱，已完成了人X染色体Xp11.2-p21.3跨度的约35cM STS－YAC图谱的构建；建立了YAC－cDNA筛选技术。 　　目前的研究工作还包括: 疾病和功能相关新基因的分离、测序和克隆的技术和方法学的创新研究；中国少数民族HLA分型研究及特种基因的分析； 人胎脑cDNA文库的构建和新基因的克隆研究。 　　中国是世界上人口最多的国家，有５６ 个民族和极为丰富的病种资源，并且由于长期的社会封闭，在一些地区形成了极为难得的族群和遗传隔离群，一些多世代、多个体的大家系具有典型的遗传性状，这些都是克隆相关基因的宝贵材料。但是，由于我国的HGP 研究工作起步较晚、底子薄、资金投入不足，缺乏一支稳定的、高素质的青年生力军， 我国的ＨＧＰ 研究工作与国外近年来的惊人发展速度相比，差距还很大，并且有进一步加大的危险。如果我们在这场基因争夺战中不能坚守住自己的阵地，那么在２１ 世纪的竞争中我们又将处于被动地位：我们不能自由地应用基因诊断和基因治疗的权力，我们不能自由地进行生物药物的生产和开发，我们亦不能自由地推动其他基因相关产业的发展。 　　二、展望 　　１、生命科学工业的形成 　　由于基因组研究与制药、生物技术、农业、食品、化学、化妆品、环境、能源和计算机等工业部门密切相关，更重要的是基因组的研究可以转化为巨大的生产力，国际上一批大型制药公司和化学工业公司大规模纷纷投巨资进军基因组研究领域，形成了一个新的产业部门，即生命科学工业。 　　世界上一些大的制药集团纷纷投资建立基因组研究所。Ciba-Geigy 和Ssandoz合资组建了Novartis 公司，并斥资2.5亿美元建立研究所，开展基因组研究工作。Smith Kline 公司花1.25亿美元加快测序的进度，将药物开发项目的25％建立在基因组学之上。Glaxo-Wellcome 在基因组研究领域投入4，700万美元，将研究人员增加了一倍。 　　大型化学工业公司向生命科学工业转轨。孟山都公司早在1985年就开始转向生命科学工业。至1997年，该公司向生物技术和基因组研究的投入已高达66亿美元。1998年4月，杜邦公司宣布改组成三个实业单位，由生命科学领头。1998年5月，该公司又宣布放弃能源公司Conaco，将其改造成一家生命科学公司。Dow化学公司用9亿美元购入Eli Lilly公司40％的股票，从事谷物和食品研究，后又成立了生命科学公司。Hoechst公司则出售了它的基本化学品部门，转项投资生物技术和制药。 　　传统的农业和食品部门也出现了向生物技术和制药合并的趋势。Genzyme Transgenics 公司培养出的基因工程羊能以较高的产量生产抗凝血酶III，一群羊的酶产量相当于投资1.15亿美元工厂的产量。据估计，转基因动物生产的药物成本是大规模细胞培养法的十分之一。一些公司还在研究生产能抗骨质疏松的谷物，以及大规模生产和加工基因工程食品。 　　能源、采矿和环境工业也已在分子水平上向基因组研究汇合。例如，用产甲烷菌Methanobacterium 作为一种新能源。用抗辐射的细菌Deinococcus radiodurans清除放射性物质的污染，并在转入tod基因后，在高辐射环境下清除多种有害化学物质的污染。 　　２、功能基因组学 　　人类基因组计划当前的整体发展趋势是什么？一方面，在顺利实现遗传图和物理图的制作后，结构基因组学正在向完成染色体的完整核酸序列图的目标奋进。另一方面，功能基因组学已提上议事日程。人类基因组计划已开始进入由结构基因组学向功能基因组学过渡、转化的过程。在功能基因组学研究中，可能的核心问题有：基因组的表达及其调控、基因组的多样性、模式生物体基因组研究等。 　　（１）基因组的表达及其调控 　　１）基因转录表达谱及其调控的研究 　　一个细胞的基因转录表达水平能够精确而特异地反映其类型、发育阶段以及反应状态，是功能基因组学的主要内容之一。为了能够全面地评价全部基因的表达，需要建立全新的工具系统，其定量敏感性水平应达到小于1个拷贝/细胞，定性敏感性应能够区分剪接方式，还须达到检测单细胞的能力。近年来发展的DNA微阵列技术，如DNA芯片，已有可能达到这一目标。 　　研究基因转录表达不仅是为了获得全基因组表达的数据，以作为数学聚类分析。关键问题是要解析控制整个发育过程或反应通路的基因表达网络的机制。网络概念对于生理和病理条件下的基因表达调控都是十分重要的。一方面，大多数细胞中基因的产物都是与其它基因的产物互相作用的；另一方面，在发育过程中大多数的基因产物都是在多个时间和空间表达并发挥其功能，形成基因表达的多效性。在一个意义上，每个基因的表达模式只有放到它所在的调控网络的大背景下，才会有真正的意义。进行这方面的研究，有必要建立高通量的小鼠胚胎原位杂交技术。 　　2）蛋白质组学研究 　　蛋白质组学研究是要从整体水平上研究蛋白质的水平和修饰状态。目前正在发展标准化和自动化的二维蛋白质凝胶电泳的工作体系。首先用一个自动系统来提取人类细胞的蛋白质，继而用色谱仪进行部分分离，将每区段中的蛋白质裂解，再用质谱仪分析，并在蛋白质数据库中通过特征分析来认识产生的多肽。 　　蛋白质组研究的另一个重要内容是建立蛋白质相互关系的目录。生物大分子之间的相互作用构成了生命活动的基础。组装基因组各成分间的详尽作图已在T7噬菌体（55个基因）获得成功。如何在模式生物（如酵母）和人类基因组的研究中建立自动方法，认识不同的生化通路，是值得探讨的问题。 　　3）生物信息学的应用 　　目前，生物信息学已大量应用于基因的发现和预测。然而，利用生物信息学去发现基因的蛋白质产物的功能更为重要。模式生物体中越来越多的蛋白质构建编码单位被识别，无疑为基因和蛋白质同源关系的搜寻和家族的分类提供了极其宝贵的信息。同时，生物信息学的算法、程序也在不断改善，使得不仅能够从一级结构，也能从估计结构上发现同源关系。但是，利用计算机模拟所获得的理论数据，还需要经过实验经过的验证和修正。 　　（2）基因组多样性的研究 　　人类是一个具有多态性的群体。不同群体和个体在生物学性状以及在对疾病的易感性与抗性上的差别，反映了进化过程中基因组与内、外部环境相互作用的结果。开展人类基因组多样性的系统研究，无论对于了解人类的起源和进化，还是对于生物医学均会产生重大的影响。 　　1）对人类DNA的再测序 　　可以预测，在完成第一个人类基因组测序后，必然会出现对各人种、群体进行再测序和精细基因分型的热潮。这些资料与人类学、语言学的资料项结合，将有可能建立一个全人类的数据库资源，从而更好地了解人类的历史和自身特征。另外，基因组多样性的研究将成为疾病基因组学的主要内容之一，而群体遗传学将日益成为生物医药研究中的主流工具。需要对各种常见多因素疾病（如高血压、糖尿病和精神分裂症等）的相关基因及癌肿相关基因在基因组水平进行大规模的再测序，以识别其变异序列。 　　2）对其它生物的测序 　　对进化过程各个阶段的生物进行系统的比较DNA测序，将揭开生命35亿年的进化史。这样的研究不仅能勾画出一张详尽的系统进化树，而且将显示进化过程中最主要的变化所发生的时间及特点，比如新基因的出现和全基因组的复制。 　　认识不同生物中基因序列的保守性，将能够使我们有效地认识约束基因及其产物的功能性的因素。对序列差异性的研究则有助于认识产生大自然多样性的基础。在不同生物体之间建立序列变异与基因表达的时空差异之间的相关性，将有助于揭示基因的网络结构。 　　（3）开展对模式生物体的研究 　　1）比较基因组研究 　　在人类基因组的研究中，模式生物体的研究占有极其重要的地位。尽管模式生物体的基因组的结构相对简单，但是它们的核心细胞过程和生化通路在很大程度上是保守的。这项研究的意义是：1〕有助于发展和检验新的相关技术，如大规模测序、大规模表达谱检验、大规模功能筛选等；2〕通过比较和鉴定，能够了解基因组的进化，从而加速对人类基因组结构和功能的了解；3〕模式生物体间的比较研究，为阐明基因表达机制提供了重要的线索。 　　目前对于基因组总体结构组成方面的知识，主要来源于模式生物体的基因组序列分析。通过对不同物种间基因调控序列的计算机分析，已发现了一定比例的保守性核心调控序列。根据这些序列建立的表达模式数据库对破译基因调控网络提供了必要的条件。 　　2）功能缺失突变的研究 　　识别基因功能最有效的方法，可能是观察基因表达被阻断后在细胞和整体所产生的表型变化。在这方面，基因剔除方法（knock-out）是一项特别有用的工具。目前。国际上已开展了对酵母、线虫和果蝇的大规模功能基因组学研究，其中进展最快的是酵母。欧共体为此专门建立了一个称为EUROFAN(European Functional Analysis Network)的研究网络。美国、加拿大和日本也启动了类似的计划。 　　随着线虫和果蝇基因组测序的完成，将来也可能开展对这两种生物的类似性研究。一些突变株系和技术体系建立后，不仅能够成为研究单基因功能的有效手段，而且为研究基因冗余性和基因间的相互作用等深层次问题奠定了基础。小鼠作为哺乳动物中的代表性模式生物，在功能基因组学的研究中展有特殊的地位。同源重组技术可以破坏小鼠的任何一个基因，这种方法的缺点是费用高。利用点突变、缺失突变和插入突变造成的随机突变是另一中可能的途径。对于人体细胞而言，建立反义寡核苷酸和核酶瞬间阻断基因表达的体系可能更加合适。蛋白质水平的剔除术也许是说明基因功能最有力的手段。利用组合化学方法有望生产出化学剔除试剂，用于激活或失活各种蛋白质。 　　总之，模式生物体的基因组计划为人类基因组的研究提供了大量的信息。今后，模式生物体的研究方向是将人类基因组8～10万个编码基因的大部分转化为已知生化功能的多成分核心机制。而要获得酶一种人类进化保守性核心机制的精细途径，以及它们的紊乱导致疾病的各种途径的知识，将只能来自对人类自身的研究。 　　通过功能基因组学的研究，人类最终将将能够了解哪些进化机制已经确实发生，并考虑进化过程还能够有哪些新的潜能。一种新的解答发育问题的方法可能是，将蛋白质功能域和调控顺序进行重新的组合，建立新的基因网络和形态发生通路。也就是说，未来的生物科学不仅能够认识生物体是如何构成和进化的，而且更为诱人的是产生构建新的生物体的可能潜力。